在實驗室和海洋中構(gòu)建用于測量浮游植物生物量、生理學(xué)和光合作用的高級熒光系統(tǒng)

1.    研究目的和內(nèi)容

  研究目的

       該項目的目的是建造一種小型的臺式儀器，稱為F熒光I誘導(dǎo)和R馳預(yù)（mini-FIRe）系統(tǒng)，用于離散樣品分析和連續(xù)測量浮游植物在海洋中的豐度和生理狀況。與Rutgers團(tuán)隊發(fā)明和開發(fā)的前代FRRF和FIRe熒光儀不同，新儀器將表現(xiàn)出增強(qiáng)的靈敏度（約10倍），可實時提供更多生理參數(shù)。新儀器的高靈敏度使得它們對于在公海的實地工作有巨大價值。

研究內(nèi)容

       使用可變熒光技術(shù)對浮游植物和其他光合作用生物的光合作用活性的評估 - 光合作用生物的生理狀態(tài)的快速和無損評估依賴于使用快速重復(fù)率熒光學(xué) （FRRF） 及其技術(shù)后續(xù)熒光感應(yīng)和放松 （FIRE） 技術(shù)。這項技術(shù)是由Rutgers團(tuán)隊發(fā)明和開發(fā)的。評估光合作用生物生存能力的基本方法依賴于葉綠素"可變熒光"剖面的測量和分析，葉綠素是光合作用機(jī)構(gòu)*的特性（Falkowski等人于2005年對此進(jìn)行了審查）。"可變熒光"技術(shù)依賴于葉綠素?zé)晒馀c光合作用過程效率之間的關(guān)系，并提供了一套全面的熒光和光合作用參數(shù)的有機(jī)體。光學(xué)測量是靈敏的，快速的，無損的，可以實時和原位完成。

        這種方法和已實現(xiàn)的儀器學(xué)原理是在同行評審文獻(xiàn)中確立的（Falkowski and Kolber 1995; Kolber at al., 1998; Gorbunov et al., 2000, 2001; Gorbunov and Falkowski 2004）。最初是為研究水柱中的浮游植物而開發(fā)的，F(xiàn)RR技術(shù)提供了準(zhǔn)確的信息，說明浮游植物群落的運作以及控制海洋初級生產(chǎn)力的環(huán)境因素的影響（e.g., Falkowski and Kolber 1995; Falkowski and Raven 2007; Behrenfeld et al., 1996; Coale et al, 2004; Falkowski et al, 2004）。使用臺式和潛水式FRR和FIRe熒光儀成為美國和世界上大多數(shù)生物海洋學(xué)項目不可分割的一部分。

       已開發(fā)出F熒光I誘導(dǎo)和R馳預(yù)（FIRe）技術(shù) ，以測量光合作用生物的一套全面的光合作用和生理特征（Gorbunov and Falkowski 2005）。 FIRe 技術(shù)基于對由一系列激發(fā)閃光引起的熒光瞬態(tài)的記錄和分析，這些閃光的強(qiáng)度、持續(xù)時間和間隔精確控制（圖 1 和 Gorbunov and Falkowski 2005）。 該技術(shù)提供了一套全面的參數(shù)，這些參數(shù)的特點是光合作用采光過程、光系統(tǒng) II （PSII） 中的光化學(xué)以及光合作用電子傳輸?shù)教脊潭?。由于這些過程對環(huán)境因素特別敏感，F(xiàn)IRe 技術(shù)為識別和診斷自然（營養(yǎng)限制、光化學(xué)和光刺激、熱應(yīng)力等）和人為應(yīng)激因素（如污染）提供了基礎(chǔ)。

圖1。FIRe 熒光瞬時的例子。熒光產(chǎn)量的動力學(xué)記錄為微秒時間分辨率，包括四個階段：（一階段，100  ms）100 ms的強(qiáng)短脈沖（稱為單周轉(zhuǎn)閃光，STF）適用于累積飽和PSII，并測量從Fo到Fm（STF）的熒光感應(yīng)：（第二階段，500ms）弱調(diào)制光用于記錄500ms時間尺度上熒光產(chǎn)量的放松動能：（第三階段，50 ms）50ms 持續(xù)時間的強(qiáng)長脈沖（稱為多周轉(zhuǎn)閃光，MTF）用于飽和 PSII 和 PQ 庫：（第 4 階段，1 s） 弱調(diào)制光用于記錄 PQ 庫在 1s 的時間尺度內(nèi)再氧化的動力學(xué)。  第 1 階段的分析提供：最小和至大熒光產(chǎn)量（Fo，F(xiàn)m）；PSII光化學(xué)電荷分離的量子效率Fv/Fm（STF）；PSII 的功能橫截面，σPSII; 和連接因子（p）。第 2 階段為 PSII 接收方的電子傳輸提供時間常數(shù)（即Qa 受體側(cè)再氧化）。第 3 階段提供 Fm（MTF）和 Fv/Fm（MTF）。第 4 階段揭示了 PSII 和 PSI 之間的電子傳輸時間常數(shù)（PQ 庫的再氧化）。

       可變熒光技術(shù)的生物物理背景- 在室溫下，葉綠素?zé)晒庵饕a(chǎn)生于PSII。當(dāng)PSII反應(yīng)中心處于開放狀態(tài)（Qa氧化）時，熒光產(chǎn)量極小，F(xiàn)o。當(dāng) Qa 還原（例如，通過暴露在強(qiáng)光下）時，反應(yīng)中心關(guān)閉，熒光產(chǎn)量增加到其高水平 Fm。為了檢測Fo和Fm，F(xiàn)IRe技術(shù)記錄了由強(qiáng)烈的飽和脈沖光（~100 μs，稱為單周轉(zhuǎn)閃光，STF）引起的熒光感應(yīng)（圖1第1階段）。熒光感應(yīng)率與PSII的功能吸收橫截面成正比，而熒光上升的相對幅度Fv/Fm則由PSII光化學(xué)的量子效率來定義。熒光感應(yīng)的形狀由單個光合作用單元之間的激發(fā)量轉(zhuǎn)移控制，并由"連接因子"（Kolber et al. 1998）定義。因此，在沒有能量轉(zhuǎn)移（p = 0）的情況下，熒光感應(yīng)呈指數(shù)級，當(dāng)p 增加到 ~0.5 到 0.7 的至大值時，就會變成反曲線。

       PSII 受體側(cè)電子傳輸?shù)膭幽埽碤a再氧化）是通過 STF 之后的熒光馳預(yù)動力學(xué)分析（圖 1 第 2 階段）評估的。熒光動力學(xué)由幾個部分組成，因為Qa再氧化的速度取決于第二個電子受體Q b的狀態(tài)，Qb作為移動雙電子受體工作：

Qa- Qb  →  Qa Qb- (150 - 200 ms)                                (1)

Qa- Qb- →  Qa Qb= (600 - 800 ms)                                 (2)

Qa- _  →  Qa- Qb →  Qa Qb- (~ 2000 ms)                    (3)

       反應(yīng) （3） 與 Qb 最初脫離 D1 蛋白結(jié)合位點時的條件相對應(yīng)。此外，一小部分電子傳輸受損的失活反應(yīng)中心可能有助于馳預(yù)動力學(xué)中最慢的組件。FIRe 軟件使用 3 組件分析處理馳預(yù)動力學(xué)，以檢索電子傳輸?shù)臅r間常數(shù)（即 Q 氧化 tQa）。

       PSII 和 PSI 之間的電子傳輸?shù)臅r間常數(shù) tPSII-PSI 是從多周轉(zhuǎn)閃光（MTF，圖 1 中的第 3 階段和第 4 階段）之后的熒光馳預(yù)動力學(xué)分析中檢索到的。 在大多數(shù)生理條件下，這個時間常數(shù)是由質(zhì)體醌（PQ）庫再氧化的速度決定的，并且是一個數(shù)量級比tQa慢一個數(shù)量級。

       測量一系列環(huán)境光強(qiáng)的FIRe熒光參數(shù)，可以重建光合作用電子傳輸?shù)乃俾?，Pf，作為光強(qiáng)的函數(shù)（光合作用與光強(qiáng)曲線）（Kolber and Falkowski, 1993）。Pf 與光照產(chǎn)物和環(huán)境光下測量的光化學(xué)量子產(chǎn)量成正比（DF'/Fm'）。分析這些光合作用與光強(qiáng)曲線提供了光合作用至大電子傳遞速率（Pmax）和光飽和系數(shù)（Ek）。光合作用與輻射測量使用 FIRe 的光化光源 （ALS） 進(jìn)行，該光源通過 FIRe 數(shù)據(jù)采集軟件由計算機(jī)控制。

       研發(fā)背景和專業(yè)知識 – Rutgers團(tuán)隊的成員在可變熒光技術(shù)和方法的研發(fā)方面積累了超過 20 年的經(jīng)驗。他們發(fā)明并開發(fā)了10多項生物物理研究的*儀器（參見相關(guān)同行評審出版物的附錄參考清單）。

2. 儀器介紹

       mini-FIRe基于與之前臺式FIRe儀器相同的生物物理原理（Gorbunov and Falkowski 2005），但新儀器更緊湊3倍，靈敏度提高10倍。葉綠素濃度的下限低至 ~0.005 mg/m3，這使得mini- FIRe對于在公海進(jìn)行現(xiàn)場采樣非常有價值。

       在這里，Rutgers團(tuán)隊提議建造一個mini-FIRe（圖2）該儀器將用于離散樣品分析（例如，從站點的尼斯金瓶收集的樣品）和/或在海洋中持續(xù)進(jìn)行取樣。儀器將配備一個流經(jīng)的樣品室，用于連續(xù)繪制浮游植物生物量和光合作用特性。以下是mini-FIRe記錄的生理參數(shù)列表和儀器技術(shù)規(guī)格mini-FIRe（圖2）。該儀器將用于離散樣品分析（例如，從站點的尼斯金瓶收集的樣品）和/或在海洋中持續(xù)進(jìn)行取樣。該儀器將配備一個流經(jīng)的樣品室，用于連續(xù)繪制浮游植物生物量和光合作用特性。以下是mini-FIRe記錄的生理參數(shù)列表和儀器技術(shù)規(guī)格。

圖2 mini-FIRe熒光儀，具有增強(qiáng)的靈敏度。

測量參數(shù)：

●暗適應(yīng)后最小和至大熒光產(chǎn)量（Fo， Fm）

●光適應(yīng)下有效、最小和至大熒光產(chǎn)量（F'， Fo'， Fm'） *

●光系統(tǒng)II、PSII 中光化學(xué)至大有效量子產(chǎn)量（Fv/Fm 和DF'/F m））

●三波長下功能性PSII吸收截面積（sPSII）

●光合作用單元之間的能量轉(zhuǎn)移效率（"連接因子"）

●PSII 受體側(cè)電子傳遞時間常數(shù)（Q a 到Qb，Qa 到 Qb-）

●PSII 和 PSI 之間的光合作用電子傳輸時間常數(shù)

●電子傳遞速率，ETR，作為光強(qiáng)的函數(shù) *

●光化學(xué)淬火系數(shù) （qP）和非光化學(xué)淬火系數(shù) （NPQ） *

●至大光合速率、初始斜率和光合作用周轉(zhuǎn)時間（從 F 與 E 曲線得到）

●這些參數(shù)是使用光化光源 （ALS） 測量，并記錄為光強(qiáng)曲線。

mini-FIRe 系統(tǒng)的技術(shù)規(guī)格：

●靈敏度：0.005 - 100 mg/m3葉綠素a（可通過添加中性密度減壓過濾器提高采樣濃度）

●激發(fā)光源：藍(lán)色（峰值波長450 nm，30 nm帶寬），綠色（峰值波長530 nm，40 nm帶寬），橙色（峰值波長590 nm，30 nm帶寬），用于選擇性激發(fā)不同功能組的浮游植物。

●發(fā)射檢測：680 nm（葉綠素a）和880 nm（細(xì)菌葉綠素a），其他波長可使用可更換的發(fā)射濾光片進(jìn)行選擇。

●尺寸： 10 x 5 x 12 英寸